جداسازی، همسانه سازی و بیان ژن RNA پلیمراز باکتریوفاژ T7 در باکتری E. coli به منظور تولید تجاری - لیلا داوروش; مقصود پژوهنده; محمد احمدآبادی (زیست‌شناسی کاربردی)
مقدمه: آنزیم RNA پلیمراز باکتریوفاژ T7، در رونویسی و بیان پروتئین‌های نوترکیب استفاده می‌شود. این آنزیم به فاکتور دیگری برای شناسایی پیشبر نیاز نداشته، بسیار اختصاصی عمل می‌کند و فقط ژن‌های تحت کنترل پیشبر T7 را بیان می-نماید. این ویژگی‌ها موجب شده است که تولید آنزیم T7 RNA پلیمراز در بیوتکنولوژی بسیار پر اهمیت باشد.مواد و روشها: در این تحقیق، برای تولید انبوه و کم هزینه این آنزیم، سویه باکتریوفاژ T7 به‌عنوان الگو مورد استفاده قرار گرفت. واکنش PCR با استفاده از آغازگر‌های اختصاصی که حاوی سایت برشی برای آنزیم‌های BamHI و EcoRI بود انجام گرفت. پس از الکتروفورز محصول PCR، ژن تکثیر شدهT7 RNA پلیمیراز و پلاسمید pGEX2TK توسط این آنزیم‌ها برش داده شدند و پس از خالص‌سازی، واکنش لیگاسیون بین آن‌ها صورت گرفت. پلاسمید نوترکیب pGEX-T7RNAPol با الکتروپوراسیون به باکتری E. coli منتقل شد. گزینش باکتری‌های حاوی پلاسمید نوترکیب به کمک PCR انجام گرفت. نتایج: پس از تایید پلاسمید حاصل، با برش آنزیمی و همچنین با PCR، توالی‌یابی آن انجام و درستی آن مطابق توالی ثبت شده در NCBI تایید شد. پلاسمید نوترکیب به منظور بیان پروتئین مورد نظر به باکتری E. coli سویه Rosetta منتقل شد. کلنی حاوی پلاسمید انتخاب وکشت شد. بیان پروتئین با القای IPTG در باکتری صورت گرفت و پس از استخراج به کمک SDS-PAGE تایید شد. این تحقیق پیش‌نیاز تولید تجاری و انبوه آنزیم T7 RNA پلیمراز می‌باشد که پس از بهینه‌سازی بیان و خالص‌سازی پروتئین، تولید تجاری و بومی آن انجام خواهد شد.